Cell Ranger

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上一节我们学习了10X Genomics的测序原理，这节我们来看看如何使用官方推荐的软件cell ranger来分析数据。Cell Ranger是由10x Genomics公司提供的一套用于处理单细胞RNA测序数据的工具。官网对其进行了详细的介绍和使用说明。可以通过10x Genomics Cloud Analysis使用这个软件或者将其安装到本地。

安装

CellRanger必须在Linux系统下运行。首先去下载Linux版本对应的软件安装包，下载之前需要先提交许可证相关信息。然后登录自己的服务器并使用mkdir 和cd等命令建立并进入到软件安装目录。使用下面的命令下载软件。

curl -o cellranger-6.1.2.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-6.1.2.tar.gz?Expires=1641366506&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci02LjEuMi50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2NDEzNjY1MDZ9fX1dfQ__&Signature=kaV8~ZabHhyDykUhbN~F78PDQfNZ64IamgsGc1nOSghFKPr0fbZ3WJk-2eWYh7IEt-KupenYP89W1zHi4lrxF~ZBbuP4NTaKEAa-G6ILJoX-VdyFnktkXFYDHgzEJ8ABq-NM6RWn20WD3a9BITNHTIWPtxjM-NaXAuR5uc5PuAEgjSDaQ2QBAQr~1q4aSM-~vJt~ia5e8acTz9RlM24EluLqfO59VCtAorP-5iJRwvLw9DjfrTlDtWfy3M2LSXp5OGmVJH1WUQReLK~0iZX2e8~vrHlAYpuxMa0Lgil6oHQ5s6vc~Dod3Aqpjb9sM~wuVo80zi4EqJ5nq0LU8SNbiQ__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

如果系统没有curl命令，可以使用wget命令，复制如下命令行：

wget -O cellranger-6.1.2.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/cell-exp/cellranger-6.1.2.tar.gz?Expires=1641366506&Policy=eyJTdGF0ZW1lbnQiOlt7IlJlc291cmNlIjoiaHR0cHM6Ly9jZi4xMHhnZW5vbWljcy5jb20vcmVsZWFzZXMvY2VsbC1leHAvY2VsbHJhbmdlci02LjEuMi50YXIuZ3oiLCJDb25kaXRpb24iOnsiRGF0ZUxlc3NUaGFuIjp7IkFXUzpFcG9jaFRpbWUiOjE2NDEzNjY1MDZ9fX1dfQ__&Signature=kaV8~ZabHhyDykUhbN~F78PDQfNZ64IamgsGc1nOSghFKPr0fbZ3WJk-2eWYh7IEt-KupenYP89W1zHi4lrxF~ZBbuP4NTaKEAa-G6ILJoX-VdyFnktkXFYDHgzEJ8ABq-NM6RWn20WD3a9BITNHTIWPtxjM-NaXAuR5uc5PuAEgjSDaQ2QBAQr~1q4aSM-~vJt~ia5e8acTz9RlM24EluLqfO59VCtAorP-5iJRwvLw9DjfrTlDtWfy3M2LSXp5OGmVJH1WUQReLK~0iZX2e8~vrHlAYpuxMa0Lgil6oHQ5s6vc~Dod3Aqpjb9sM~wuVo80zi4EqJ5nq0LU8SNbiQ__&Key-Pair-Id=APKAI7S6A5RYOXBWRPDA"

注意：如果上述链接失效，可以去官网复制最新命令

下载界面如下所示：

% Total    % Received % Xferd  Average Speed   Time    Time     Time  Current
                               Dload  Upload   Total   Spent    Left  Speed
100  767M  100  767M    0     0   124M      0  0:00:06  0:00:06 --:--:--  131M

下载完成之后，使用ls命令查看下载的文件

$ ls #查看下载的文件
cellranger-6.1.2.tar.gz
$ tar -zxvf cellranger-6.1.2.tar.gz #解压文件，如果是.tar.xz后缀，使用tar -xvf命令
cellranger-6.1.2/
cellranger-6.1.2/.env.json
cellranger-6.1.2/.version
cellranger-6.1.2/LICENSE
cellranger-6.1.2/builtwith.json
...
$ cd cellranger-6.1.2
$ pwd #查看绝对路径
/path/to/your/workdir/cellranger-6.1.2
$ export PATH=/mnt/home/user.name/yard/apps/cellranger-6.1.2:$PATH #添加路径到系统环境中
$ cellranger #查看是否可以正常使用
USAGE:
    cellranger 

FLAGS:
    -h, --help       Prints help information
    -V, --version    Prints version information

SUBCOMMANDS:
    count            Count gene expression (targeted or whole-
                     transcriptome) and/or feature barcode reads from a
                     single sample and GEM well
    multi            Analyze multiplexed data or combined gene
                     expression/immune profiling/feature barcode data
...

使用

cellranger提供了五个分析模块用于分析单细胞转录组相关产品

1.cellranger mkfastq：

调用bcl2fastq软件将illumina测序仪得到的BCL( raw base call ）格式文件拆分为fastq文件。工作流如图所示：

一次上机测序两个不同的文库，执行一次cellranger mkfastq

一次上机测序两个不同的文库，分别执行一次cellranger mkfastq。

使用方法

$ cellranger mkfastq --id=tiny-bcl \
                     --run=/path/to/tiny_bcl \
                     --csv=cellranger-tiny-bcl-simple-1.2.0.csv

参数说明

Parameter	Function
--run	必选；BCL文件所在目录
--id	可选；mkfastq将会生成相应目录，不接受绝对路径
--samplesheet --sample-sheet	可选. 样本名字、index等信息； [Data] Lane,Sample_ID,index,index2 1,test_sample,TGGTCCCAAG,ACGCCAGAGG
--csv --simple-csv	可选，类似上面参数
…	…
--output-dir	指定FASTQ输出目录
--localcores	运行的最大CPU数
--localmem	运行的最大内存数

2.cellranger count:

分析cellranger mkfastq或者其他方式得到fastq格式的文件。这个模块包括比对、过滤、barcoding计数以及UMI计数。可以生成barcode-UMI信息，进行聚类及基因表达分析。不过我们通常用到表达信息，使用其他方式进行聚类及其他单细胞相关分析。

在分析count之前需要先下载参考基因组：

$ wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz" #人
$ wget "https://cf.10xgenomics.com/supp/cell-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz" #鼠

或者参照教程使用cellranger mkref自己构建参考基因组

$ cellranger count --id=sample345 \
                   --transcriptome=/opt/refdata-gex-GRCh38-2020-A \
                   --fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
                   --sample=mysample \
                   --localcores=8 \
                   --localmem=64

输出结果包括以下信息：

Outputs:
- Run summary HTML:                 /outdir/outs/web_summary.html
- Run summary CSV:                  /opt/sample345/outs/metrics_summary.csv
- BAM:                              /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam
- BAM index:                        /opt/sample345/outs/possorted_genome_bam.bam.bai
- Filtered feature-barcode matrices MEX: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix
- Filtered feature-barcode matrices HDF5: /opt/sample345/outs/filtered_feature_bc_matrix.h5
......

count分析完成之后可以使用浏览器打开web_summary.html文件查看报告，网页版报告主要包括以下几个方面的内容：

Summary包括鉴定到的细胞数、reads数中值、基因数中值、比对率、饱和度等基本信息

Gene Expression View包括T-SNE降维结果、初步的聚类及每个cluster的高表达基因。

建议结果部分我们重点关注Summary，来判断文库构建及测序是否合格。

3.cellranger multi:

用于分析细胞混合或者固定RNA数据，和count类似，multi也包括比对、过滤、barcoding计数以及UMI计数。可以生成barcode-UMI信息，进行聚类及基因表达分析等。

4.cellranger aggr:

用于整合count或者multi的结果。

5.cellranger reanalyze:

对count multi aggr的结果进行重新分析，分析过程中可以调整参数以达到重新聚类的目的。

总结

不同情景下各模块的分析如下所示：

单样本单次建库单次测序：mkfastq+count

单样本单次建库多次上机：多个mkfastq+单次count

单样本多次建库单次上机：单次mkfastq+多次count+单次aggr

多样本多次建库单次上机：单次mkfastq+多次count+单次aggr

多样本单次建库单次上机：单次mkfastq+单次multi

多样本单次建库单次上机：单次mkfastq+单次multi

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本文地址：http://bioschool.cn/omics/scrna/cell-ranger/

Suyx 单细胞转录组 2024-01-19 1316

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